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Nov 02, 2023

Schnelle Antibiotika-Empfindlichkeitstests und Artenidentifizierung für gemischte Proben

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 6215 (2022) Diesen Artikel zitieren 10.000 Zugriffe 7 Zitate 22 Details zu altmetrischen Metriken Antibiotikaresistenz ist weltweit ein zunehmendes Problem

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 6215 (2022) Diesen Artikel zitieren

10.000 Zugriffe

7 Zitate

22 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Antibiotikaresistenzen sind weltweit ein zunehmendes Problem. Ein schneller Antibiotika-Empfindlichkeitstest (AST) ist in der Klinik dringend erforderlich, um personalisierte Verschreibungen in Umgebungen mit hoher Resistenz zu ermöglichen und den Einsatz von Breitbandmedikamenten einzuschränken. Aktuelle schnelle phänotypische AST-Methoden umfassen keine Artenidentifizierung (ID), so dass zeitaufwändiges Ausplattieren oder Kultivieren die einzige verfügbare Option ist, wenn für die Empfindlichkeitsbestimmung eine Identifizierung erforderlich ist. Hier beschreiben wir eine Methode zur Durchführung phänotypischer AST auf Einzelzellebene in einem Mikrofluidikchip, die eine anschließende Genotypisierung durch In-situ-FISH ermöglicht. Durch Stratifizierung der phänotypischen AST-Reaktion auf die Spezies einzelner Zellen ist es möglich, das Anfälligkeitsprofil für jede Spezies in einer gemischten Probe in 2 Stunden zu bestimmen. In dieser Machbarkeitsstudie demonstrieren wir die Wirkungsweise mit vier Antibiotika und Mischproben mit Kombinationen aus sieben Arten.

Der rasche Anstieg der Antibiotikaresistenz stellt eine ernsthafte Bedrohung für die menschliche Gesundheit dar; Der Zugang zu wirksamen Antibiotika ist ein Grundpfeiler der modernen Medizin und eine Voraussetzung beispielsweise für die Behandlung von Krebs und Operationen. In verschiedenen Untersuchungen1,2 wird der Ernst der Lage unterschiedlich eingeschätzt, es besteht jedoch Einigkeit darüber, dass Maßnahmen ergriffen werden müssen, da sonst die Kosten sowohl im Hinblick auf menschliches Leid als auch auf die globale Wirtschaft erschreckend hoch sein werden3. Experten sind sich außerdem einig, dass das Problem zumindest teilweise auf den wahllosen Einsatz und Missbrauch einer breiten Palette von Antibiotika zurückzuführen ist4. Um dieses Problem zu lösen, sind personalisierte und schnelle Antibiotika-Empfindlichkeitstests (ASTs) erforderlich, idealerweise direkt am Behandlungsort5. Ohne diese Hilfsmittel bleibt den Ärzten in vielen Fällen nichts anderes übrig, als Breitbandantibiotika zu verschreiben, da die Identifizierung des/der Erreger und des Resistenzprofils mehrere Tage dauern kann.

Die Einschränkungen herkömmlicher phänotypischer ASTs (Scheibendiffusions-Agar-Verdünnung oder Brühen-Mikroverdünnung) bestehen darin, dass sie ein Bakterienwachstum über längere Zeiträume in Anwesenheit und Abwesenheit von Antibiotika erfordern, um eine Wirkung zu erzielen. Bei bestimmten Arten bakterieller Infektionen kann jedoch bereits eine Verzögerung von 6 Stunden vor Beginn der Behandlung schwerwiegende Folgen haben6. Ein Beispiel dafür ist die Sepsis, bei der das Sterberisiko mit jeder Stunde, in der keine wirksame Behandlung erfolgt, schätzungsweise um 7,6 % steigt7. Darüber hinaus wird gezeigt, dass ohne schnelle AST mehr als 25 % der septischen Patienten von Ärzten mit ungeeigneten Antibiotika behandelt wurden, was stark mit der Mortalität verbunden ist8,9,10. Daher sind schnelle und genaue ASTs erforderlich, um Leben zu retten. Angesichts des Anstiegs der Antibiotikaresistenz sind jedoch nicht lebensbedrohliche Erkrankungen die Hauptursache, sondern der massive Einsatz von Antibiotika bei harmloseren Erkrankungen11. Die Erschöpfung wirksamer Antibiotika wird auch durch die Strategie vorangetrieben, Erstlinienantibiotika auszutauschen, wenn die lokale Resistenzprävalenz etwa 10–20 % erreicht hat. Wenn schnelle und zuverlässige ASTs verfügbar wären, könnten hochresistente Antibiotika für 80–90 % der noch anfälligen Infektionen eingesetzt werden.

Der offensichtliche Bedarf und die Vorteile der schnellen AST, sowohl zur Rettung von Leben als auch zur Orientierung bei der Verschreibung, haben im letzten Jahrzehnt zur Entwicklung mehrerer neuer Methoden geführt. Diese Methoden werden in mehreren neueren Übersichten beschrieben, z. B.4,12, und wir werden hier nicht alle Vor- und Nachteile der verschiedenen Methoden wiederholen. Kurz gesagt können diese Methoden in zwei Kategorien unterteilt werden: genotypische und phänotypische. Genotypische Methoden identifizieren spezifische genetische Marker, die mit Antibiotikaresistenzen verbunden sind. Obwohl diese Methoden das Vorhandensein spezifischer Resistenzgene schnell nachweisen können, hängen sie von unserem Wissen über die Resistenzmechanismen ab, das bei weitem nicht vollständig ist13, insbesondere angesichts der raschen Entstehung neuer Resistenzmechanismen. Darüber hinaus ist das Fehlen von Resistenzgenen kein Hinweis auf eine Anfälligkeit gegenüber Antibiotika14, d. h. Sie lernen möglicherweise, was Sie nicht verwenden sollten, aber nicht, was wirkt. Bei phänotypischen Methoden werden die Bakterien einem Antibiotikum ausgesetzt und ihre phänotypische Reaktion, z. B. Lyse oder Verringerung der Wachstumsrate, wird überwacht. Phänotypische Methoden funktionieren unabhängig vom Resistenzmechanismus. Wenn die phänotypische Reaktion vorhanden ist, ist das Bakterium anfällig. Die verschiedenen schnellen phänotypischen ASTs, die auf den Markt gekommen sind, können innerhalb von 2–6 Stunden eine Antwort (anfällig oder resistent) für positive Blutkulturen liefern, die >6 Stunden nach der Probenahme beim Patienten gewachsen sind. Bei anderen Proben, z. B. Urin, kann die Zeit bis zur Antwort bei gramnegativen Spezies auf 30 Minuten verkürzt werden, indem die Probe direkt in einen Mikrochip geladen und die Wachstumsrate mit und ohne Antibiotika gemessen wird15.

Eine Einschränkung aller schnellen phänotypischen AST-Methoden besteht darin, dass sie nur funktionieren, wenn die Bakterienart bekannt ist. Für Infektionen mit einem engen Spektrum an Krankheitserregern ist eine detaillierte Speziesidentifizierung nicht erforderlich16, für Sepsis und andere komplexere Infektionen ist sie jedoch unerlässlich. Die MALDI-TOF-Massenspektrometer sind derzeit der goldene Standard für die Artenbestimmung17. MALDI-TOF erfordert jedoch immer noch eine Vorkultur einzelner Bakterienarten und funktioniert möglicherweise nicht gut bei gemischten Infektionen, die häufig unter anderem bei Sepsis, Wunden, katheterassoziierten Harnwegsinfekten18 und ambulant erworbener Lungenentzündung auftreten19. Die Herausforderung bleibt, eine schnelle phänotypische AST mit Arten-ID zu erstellen.

Um dieses Problem anzugehen, verwenden wir einen Mikrofluidik-Chip, um einzelne Bakterien aus einer Probe schnell zu erfassen und ihr Wachstum mit und ohne Antibiotika optisch zu überwachen. Als nächstes identifizieren wir die Bakterienspezies durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) mit artspezifischen ssDNA-Sonden, die auf die 16s/23s-rRNA-Sequenz abzielen. Sobald wir die Spezies-ID und die AST-Reaktion für jedes Bakterium im Mikrofluidik-Chip haben, stratifizieren wir die AST-Reaktion nach Spezies, was bedeutet, dass wir Proben mit gemischten Spezies haben können. Eine schematische Übersicht über den Ansatz ist in Abb. 1 dargestellt.

a Eine Zeichnung des Mikrofluidik-Aufbaus mit den auf dem Chip geladenen gemischten Spezies. b Zeitraffer-Phasenkontrastbilder der Zellen in den Fallen, wenn sie in Medien mit (oben) und ohne (unten) Antibiotika gezüchtet werden. c Fluoreszenzbilder der Bakterien mit ssDNA-Sonden, die zur Artenidentifizierung auf die ribosomale RNA spezifischer Bakterien abzielen. d Analyse von Zeitraffer-Stapeln und Arten-ID mithilfe von Deep Learning zur Segmentierung und Verfolgung von Zellen. e Nachweis von AST-Profilen für einzelne Krankheitserreger bei einer bestimmten Antibiotikakonzentration. Teil von Abb. 1a, erstellt mit www.biorender.com.

In dieser Proof-of-Prinzip-Anwendung führen wir die ASTs für sieben häufige Krankheitserreger durch (Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis und Acinetobacter baumannii als Beispiele für gramnegative Stämme sowie Enterococcus faecalis und Staphylococcus aureus als Beispiele für Gram -Positive). Wir testen vier verschiedene Antibiotika aus verschiedenen Klassen: Vancomycin (Van) [Glykopeptid], Ciprofloxacin (CIP) [Fluorchinolone], Gentamicin (Gen) [ein Aminoglykosid] und Nitrofurantoin (NIT) [andere Wirkstoffe]. Abschließend zeigen wir, wie eine einrunde, mehrfarbige Kennzeichnung die gleichzeitige Identifizierung von bis zu zehn Arten ermöglicht.

Der von uns für diesen Test entwickelte Kulturchip ist in der Lage, Bakterien schnell direkt aus einer flüssigen Probe einzufangen und ermöglicht die optische Überwachung des Bakterienwachstums mit und ohne Antibiotika in Echtzeit. Das gleiche Chip-Design wurde zuvor verwendet, um Bakterien aus Blutkulturen trotz eines überwältigenden Überschusses an Blutzellen einzufangen20. Der Chip verfügt über zwei Reihen mit jeweils 3000 Zellfallen. Jede Falle misst 1,25 × 1,25 × 50 μm15 und verfügt über eine Verengung am Ende, die verhindert, dass die Bakterien aus der Falle entkommen, während gleichzeitig Medien und Sonden um die Zellen fließen können. Um eine gemischte Infektionssituation zu simulieren, wurden bakterielle Übernachtkulturen verschiedener Arten in einer Mueller Hinton (MH)-Brühe verdünnt, gepoolt und direkt in den Mikrofluidik-Chip geladen. In einem typischen Experiment dauert das Laden einer oder mehrerer Zellen in jede Falle 1 Minute bei ~105 KBE/ml. Wir versorgten die Fallen in einer der beiden Reihen mit Wachstumsmedien mit Antibiotika und in der anderen mit einfachen Wachstumsmedien.

Die phänotypische Reaktion auf das Antibiotikum wurde in etwa 60 Minuten bestimmt, indem alle 2 Minuten 100-fache Phasenkontrastbilder jeder Zelle aufgenommen und die Wachstumsraten einzelner Zellen in 10-minütigen Schiebefenstern berechnet wurden. Die phänotypische Reaktion kann auf kürzere Zeiten verschoben werden, je nachdem, welche Antibiotika in welcher Konzentration verwendet werden15. Um die Spezies jeder Bakterienzelle zu identifizieren, führten wir eine Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) mit artspezifischen, fluoreszierenden ssDNA-Sonden durch. Diese Sonden (Supplementary Data 1) binden an die häufig vorkommenden ribosomalen 16s/23s-RNA-Sequenzen und wurden bereits erfolgreich zur Artenidentifizierung in positiven Blutkulturen eingesetzt21. Die Artenklassifizierungsmethode für FISH-Signale ist in SI-Methode 3 beschrieben.

Die Durchführung einer Wachstumsratenanalyse an Proben mehrerer Spezies erfordert eine allgemeine Methode zum Erkennen und Verfolgen von Zellen unterschiedlicher Form und Größe. In Delta 2.022 wurde ein U-net23 zur Vorhersage von Zell-Hintergrund-Karten von Phasenkontrastbildern verwendet und zeigte eine hervorragende Leistung für E. coli-Zellen, sowohl in muttermaschinenähnlichen Geräten als auch auf Agarose-Pads. Allgemeinere Algorithmen zur Zellsegmentierung, wie Cellpose24 und sein Nachfolger Omnipose25, konstruieren Zellidentitäten aus Zwischenfeldern (Abb. 2a), die von einem Faltungs-Neuronalen Netzwerk, ähnlich einem U-Netz, gelernt werden. Es wurde gezeigt, dass Omnipose die Segmentierung von Bakterienzellen unabhängig von ihrer Morphologie durchführt. Ansätze, die Zellidentitäten berechnen (Cellpose, Omnipose), weisen Zellen, die eine Grenze teilen, unterschiedliche eindeutige Beschriftungen zu, während Zell-gegen-Hintergrund-Ansätze (U-net) nicht zum Trennen von Zellen, die eine Grenze teilen, verwendet werden können. Die ersteren Ansätze erfordern Zellbeschriftungen als Trainingsdaten, während die letzteren nur binäre Masken benötigen.

ein Omnipose-Netzwerk, das die Netzwerkstruktur, Eingaben und Ausgaben für das neuronale Netzwerk und die Rekonstruktion der Ausgabe zur Generierung von Zellmasken zeigt. b Quantifizierte Leistung der Zellsegmentierung in Mutter-Maschine-Geräten. Darstellung der durchschnittlichen Präzision im Vergleich zum IOU-Schwellenwert für einen Datensatz mit gemischten Arten. Der IOU-Schwellenwert definiert eine gültige Übereinstimmung zwischen der vorhergesagten Maske und den Ground-Truth-Masken. 0,5 gibt an, dass die Hälfte der Pixel korrekt abgeglichen wurde, und 1 bedeutet, dass die Pixel für jede Zelle perfekt übereinstimmen. Die durchschnittliche Genauigkeit (TP / (TP + FP + FN)) wird aus den gültigen Übereinstimmungen (TP), den keinen gültigen Übereinstimmungen (FP) und den Ground-Truth-Masken ohne gültige Übereinstimmung (FN) berechnet. c Einige Beispiele für Phasenkontrastbilder, Grundwahrheiten und Netzwerkvorhersagen von U-net und Omnipose. d Übersicht über das Tracker-Netzwerk. e Verwirrungsmatrix der Kantenvorhersagen. f Spuren von Zellen in einem Kanal des Mutter-Maschine-Geräts.

Ein Ground-Truth-Trainingsdatensatz (82 Bilder) gemischter Zellen, die in Mutter-Maschine-Geräten wachsen, wurde unter menschlicher Aufsicht mit dem LabelsToROIs-Tool26 und benutzerdefinierten Skripten (SI-Methode 1) erstellt. Für die Zellsegmentierung verwenden wir ein auf diesen Daten trainiertes Omnipose-Modell. Training und Leistung von Omnipose und U-net werden auch in SI-Methode 3 beschrieben. Die Laufzeitleistung von Rekonstruktionsschritten aus Omnipose-Netzwerkausgaben wurde um das Zweifache verbessert (SI Abb. 1b). Omnipose zeigte bei gemischten Daten eine überlegene Leistung (Abb. 2b) im Vergleich zu einem U-Net, das auf die Vorhersage binärer Masken trainiert wurde. Wir haben gezeigt, dass die Omnipose bei Daten gemischter Spezies genauso gut abschneidet wie bei Daten aus reinen E. coli-Kulturen (SI Abb. 1b, e); Die Leistung von U-Net hingegen hing von der Art ab. Abbildung 2c zeigt Phasenkontrastbilder, ihre entsprechenden Grundwahrheiten und Zellen, die mit den Ansätzen Omnipose bzw. U-net erkannt wurden.

Frühere Ansätze zur erfolgreichen E. coli-Verfolgung haben Zelllinien mithilfe von Bewertungsmechanismen basierend auf überlappenden Regionen27 oder Mutter-Tochter-Binärmasken-Vorhersagen unter Verwendung aller Merkmale der Bilder22 konstruiert. Der erste Ansatz reagiert sehr empfindlich auf die Abstimmung von Überlappungsparametern, während der zweite Ansatz rechenintensiv ist, wenn viele kleine Zellen in den Daten vorhanden sind. Inspiriert durch die jüngsten Entwicklungen bei der Verwendung siamesischer Netzwerke28 und Diagrammformulierungen29 für die allgemeine Objektverfolgung haben wir nun einen Ansatz entwickelt, der die Zellverfolgung mithilfe eines Netzwerks durchführt, das Zelleigenschaften zwischen zwei Frames vergleicht und das Vorhandensein und die Art von Verbindungen, z. B. Zellwachstum, vorhersagt oder Teilungsereignis (Abb. 2d). Trainingsdaten für dieses Netzwerk wurden mithilfe eines Simulators (SI-Methode 4) ermittelt, der Zellen unterschiedlicher Art und Wachstumsraten simuliert, die in Mutter-Maschine-Kanälen wachsen. Das Training des Tracking-Netzwerks ist in den Zusatzinformationen (SI-Methode 4) beschrieben. In Abb. 2e zeigen wir die Verwirrungsmatrix des Modells, das zur Verfolgung experimenteller Daten verwendet wird, die auf 100 zufällig generierten Zeitreihenstapeln ausgewertet wurden. Vor dem Bau der Gleise wurden die Verbindungen mit abrupten Flächenzuwächsen entfernt, da sie Zusammenführungsereignissen entsprechen, die durch Segmentierungsfehler verursacht wurden (SI-Methode 4). Abbildung 2f (links) zeigt eine einzelne segmentierte Mutter-Maschine-Falle, die über die Zeit mit Wachstums-/Bewegungsverknüpfungen (rot) und Teilungsverknüpfungen (blau) verfolgt wird. Die Artenzuordnung zu Spuren basierend auf der im letzten Bild identifizierten Arten-ID wurde nach der Zellverfolgung durchgeführt (SI-Methode 5).

Mit der Spezies-ID und der AST-Reaktion für jede Zelle im Mikrofluidik-Chip konnte die artspezifische AST-Reaktion in den gemischten Proben bestimmt werden. Hier demonstrieren wir zunächst die Fähigkeit der Methode, eine gemischte Probe aus vier verschiedenen Arten zu charakterisieren, obwohl klinische Patientenproben eher nur eine oder zwei enthalten30,31,32. Die AST-Antworten sind in Abb. 3a – d dargestellt. In jedem Experiment erhielten wir Wachstums-Reaktionskurven für drei gramnegative Stämme (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae und Pseudomonas aeruginosa) und einen grampositiven Stamm (Enterococcus faecalis). Die Experimente wurden mit vier verschiedenen Antibiotika durchgeführt: Vancomycin (Van) [Glykopeptid], Ciprofloxacin (CIP) [Fluorchinolone], Gentamicin (Gen) [ein Aminoglykosid] und Nitrofurantoin (NIT) [andere Wirkstoffe]. Wir präsentieren die Ergebnisse als Antwortdiagramme aus einzelnen Experimenten, um die klinische Probensituation zu simulieren. Zum Vergleich zeigen wir auch die durchschnittlichen Antworten an, die sich aus den Wachstumsratenmessungen ohne Arteninformationen ergeben hätten. Eine erfolgreiche AST-Profilierung wurde mit Proben erreicht, die nur 100 Bakterien/Arten enthielten. Wir verwendeten Bakterien ohne spezifische Resistenzgene, aber da einige Arten eine natürliche Resistenz gegen bestimmte Antibiotika aufweisen, variierte die AST-Reaktion je nach Art. Beispielsweise sind Pseudomonas-Arten von Natur aus resistent gegen Ciprofloxacin (Abb. 3a) und Nitrofurantoin (Abb. 3b) und ihr Wachstum blieb in Gegenwart von 1 μg/ml Ciprofloxacin oder 32 μg/ml Nitrofurantoin unbeeinflusst. Die Wachstumsrate der anderen Bakterienarten sank in Gegenwart dieser Medikamente innerhalb von 30 Minuten um mehr als 10 %. Wichtig ist, dass wir aus den durchschnittlichen, nicht nach Arten geschichteten Daten erkennen, dass wir ohne Zugriff auf die Artidentifikation die resistenten Pseudomonas in der gemischten Population nicht hätten nachweisen können. Ebenso wurde erwartungsgemäß festgestellt, dass alle Arten außer E. faecalis empfindlich gegenüber Gentamicin (2 μg/ml) (Abb. 3c) und resistent gegenüber Vancomycin (4 μg/ml) (Abb. 3d) sind.

a–d AST-Profile mit normalisierten Wachstumsraten für die vier verwendeten Antibiotika. Für jedes Antibiotikum werden die artengeschichteten Reaktionen (Mittelwert und SEM) sowie die gepoolte Reaktion (ohne Artenschichtung) angezeigt. In allen AST-Profildiagrammen stellen S und R die Anfälligkeit bzw. die Resistenz dar. Das Experiment wird einmal pro Antibiotikum durchgeführt, obwohl zur Kalibrierung mehrere nicht gemeldete Experimente durchgeführt wurden.

Es wird geschätzt, dass >90 % der klinischen Sepsisproben eine Untergruppe der zehn häufigsten bakteriellen Krankheitserreger aufweisen33. Um die Anzahl der Arten zu erhöhen, die wir identifizieren können, führten wir kombinatorisches FISH mit einem artspezifischen Adapter durch, der zwei verschiedene fluoreszierende Oligosonden binden kann. Mit Sonden in vier verschiedenen Farben kann dieser Aufbau bis zu 10 Arten identifizieren (Abb. 4a). Wir demonstrierten den kombinatorischen FISH-Ansatz, indem wir sieben im Kulturchip geladene Arten identifizierten (Abb. 4b). Die artenweise Kombination von Signalen unter Verwendung aller Adapter und Sonden ist in SI Abb. 7 dargestellt. Die Artenklassifizierung erfolgte mithilfe eines Random-Forest-Klassifikators für das 4-D-Signal, das aus der Stapelung von Bildern von vier Fluoreszenzkanälen erhalten wurde (SI-Methode 6). Um artspezifische AST-Profile mithilfe kombinatorischer FISH zu demonstrieren, führten wir Experimente mit Kombinationen zweier Arten durch, die mit unterschiedlichen Antibiotika behandelt wurden (Abb. 5). Wenn beispielsweise Escherichia coli und Enterococcus faecalis mit Vancomycin (4 μg/ml) behandelt wurden, zeigten die beiden Arten klare, unterscheidbare Wachstumsratenprofile, die jeweils Resistenz und Anfälligkeit entsprachen (Abb. 5d). Wiederholungen dieser Experimente sind in Abb. 5e – h dargestellt.

a Überblick über die kombinatorische FISH-Untersuchung zur Identifizierung mehrerer Arten. Ein Cartoon, der die verschiedenen Bakterienarten mit ihrer ribosomalen RNA veranschaulicht (links). Darstellung der spezifischen Sequenzen mit den mehreren Adaptern, die auf die ribosomale RNA einzelner Bakterien und deren Hybridisierung an die Ziel-rRNA abzielen (Mitte). Nachweissonden mit unterschiedlichen Fluorophoren. Hybridisierung von Nachweissonden an die Adaptersequenzen zusammen mit einzigartigen Sequenzen, die auf die artspezifische rRNA abzielen (rechts). b Beispielbilder (Maßstabsbalken 20 µm) gemischter Arten, die in den Mikrofluidik-Chip geladen und mit kombinatorischem FISH zur Artenidentifizierung untersucht wurden. Nach dem Hybridisierungsschritt wurden die Zellen in verschiedenen Kanälen abgebildet (PhC, Alexa 488, Cy3, Cy5 und Texas Red). Die Bakterienarten sind in Weiß (Escherichia coli), Magenta (Klebsiella pneumoniae), Cyan (Pseudomonas aeruginosa), Braun (Enterococcus faecalis), Gelb (Acinetobacter baumannii), Marineblau (Proteus mirabilis) und Rot (Staphylococcus aureus) markiert. Das Experiment mit allen sieben gemischten Arten wurde einmal durchgeführt. Ähnliche Experimente mit gemischten Adaptern und Sonden sind jedoch in Abb. 5 dargestellt.

a P. aeruginosa und A. baumannii wurden mit Gentamicin behandelt, b K. pneumoniae und S. aureus mit Ciprofloxacin, c E. coli und P. mirabilis mit Nitrofurantoin, d E. coli und E. faecalis mit Vancomycin . e–h Biologische Wiederholungen von 5a–5d. In allen AST-Profildiagrammen stehen S und R für „Anfällig“ bzw. „Resistenz“. Für jede in den Experimenten nachgewiesene Art werden normalisierte Wachstumsraten ± SEM als Funktion der Zeit angezeigt.

Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass es möglich ist, eine schnelle AST für Proben gemischter Spezies durchzuführen, indem sequenzielle Einzelzell-Phänotyp-Empfindlichkeitstests und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung in einem Mikrofluidik-Chip durchgeführt werden. Wichtig ist, dass die ID-Bestimmung auch für nicht gemischte Proben nützlich ist, wenn es wichtig ist zu wissen, welche MHK-Breakpoints für die SIR-Angabe (susceptible-intermediate-resistance) verwendet werden sollen. Obwohl die Artenbestimmung für nicht gemischte Proben mit MALDI-TOF möglich ist, erfordert sie viel mehr Bakterienzellen als die direkte Einzelzellbildgebung.

Da die Antibiotika-Empfindlichkeitsgrenzen eng verwandter Arten oft gleich sind, kann es manchmal ausreichen, die Bakterienfamilie oder -gattungen zu unterscheiden. Beispielsweise ein Enterobakterien-spezifischer Farb-ID-Code zur Abdeckung von Escherichia, Klebsiella und Salmonella, die sehr ähnliche Resistenzbruchpunkte aufweisen34. Verschiedene artspezifische Sonden würden in diesem Fall denselben Farb-ID-Code abbilden, sodass die zehn Codes effizienter genutzt werden können. Ebenso gehen wir davon aus, dass es möglich wäre, einen gemeinsamen ID-Code für kontaminierende Arten zu haben, sodass sie nicht mit Krankheitserregern verwechselt werden. Wenn jedoch mehr als 10 spezifische ID-Codes erforderlich sind, ermöglichen Stripping und Reprobing eine exponentielle Steigerung der Anzahl der identifizierbaren Klassen35,36, allerdings auf Kosten der Zeit.

In der aktuellen Implementierung haben wir den Test Konzentration für Konzentration auf einem High-End-Forschungsmikroskop durchgeführt und die Bilddaten nachbearbeitet. Um die Technologie im klinischen Umfeld nutzbar zu machen, sollten die Daten während des Experiments analysiert und der Fluidchip parallelisiert werden, um mehrere Antibiotikakonzentrationen gleichzeitig laufen zu lassen. Obwohl wir diesen Aufbautyp in der vorliegenden Studie nicht getestet haben, sollte er eine MHK-Bestimmung zur Identifizierung intermediärer Isolate ermöglichen. Für unkomplizierte Harnwegsinfektionen wurde ein System mit fünf verschiedenen Antibiotika in fünf verschiedenen Konzentrationen und einem hohen Automatisierungsgrad entwickelt20, was zeigt, dass eine Hochskalierung auf mehrere Testbedingungen möglich ist. Abschließend möchten wir betonen, dass die vorliegende Studie ein Beweis für das Prinzip der kombinierten phänotypischen AST- und Artenidentifizierung auf Einzelzellebene ist. Damit diese Methode klinisch relevant ist, muss sie kalibriert und an vielen weiteren klinischen Isolaten sowie an echten Patientenproben getestet werden.

In dieser Studie verwendeten wir als gramnegativen Vertreter E. coli K12 MG1655 (DA4201), K. pneumoniae (ATCC 13883), A. baumanni (DA68153), P. mirabilis (ATCC 29906) und P. aeruginosa (DA6215). . Als grampositive Vertreter verwendeten wir E. faecalis (ATCC 51299) und S. aureus (ATCC 29213). Wir verwendeten auch die fluoreszenzmarkierten P. aeruginosa (PAO1-GFP)-Zellen, ein freundliches Geschenk von Oana Ciofu37. Antibiotika (Ciprofloxacin, Gentamicin, Nitrofurantoin und Vancomycin) wurden von Sigma-Aldrich bezogen. Stammlösungen wurden gemäß den Richtlinien des Lieferanten hergestellt und bei –20 °C gelagert. Die Lösungen wurden vor der Durchführung der AST-Experimente auf Raumtemperatur aufgetaut. Wir haben Konzentrationen der Antibiotika verwendet, die den MHK-Werten für E. coli (ATCC 25922) entsprechen, wie vom Europäischen Komitee für antimikrobielle Suszeptibilitätstests (EUCAST) definiert. Wir stellen fest, dass eine andere, höhere Konzentration optimal sein kann, um einen schnellen SIR-Anruf zu tätigen.

In allen Experimenten wurde Mueller-Hinton (MH)-Medium (70192; Sigma-Aldrich) als Brühe verwendet. Übernachtkulturen (ONC) wurden hergestellt, indem Bakterien aus Glycerinvorräten (–80 °C) in MH-Medium beimpft und 14–15 Stunden lang bei 37 °C unter kontinuierlichem Schütteln (200 U/min) inkubiert wurden. Von ONC wurden die Zellen 1:1000-fach in frischem MH-Medium verdünnt, das mit einem Tensid (Pluronic F-108; 542342; Sigma-Aldrich; 0,085 % (Gew./Vol.) Endkonzentration) ergänzt war. Die Flüssigkultur wurde durch 2-stündiges Schütteln bei 200 U/min bei 37 °C gezüchtet. Als nächstes haben wir zur Durchführung von AST-Experimenten die verschiedenen Stämme in gleichen Konzentrationen gemischt und auf den Mikrofluidik-Chip geladen.

Der Chip besteht hauptsächlich aus zwei Teilen: einem mikrogeformten Silikonelastomer [Sylgard 184; Polydimethylsiloxan (PDMS)] und ein 1,5-Glasdeckglas (Menzel-Gläser), die kovalent miteinander verbunden sind. Chip-Design und -Vorbereitung wurden bereits in15,38 beschrieben. Diese Referenzen beschreiben auch die Nummerierung der unten verwendeten Ports. Nachdem die Anschlüsse auf dem Chip gestanzt worden waren, wurde er auf das Mikroskop gelegt und der Schlauch (TYGON) mit einem Metallschlauchverbinder verbunden. Kurz gesagt, die Zellen wurden über Port 8.0 geladen und Port 2.0 wurde für den Austausch des Mediums mit den Sonden verwendet. Die Anschlüsse 5.1, 5.2 und 6.0 dienten der Aufrechterhaltung des Rückkanaldrucks und die Anschlüsse 2.1 und 2.2 dienten der Versorgung mit MH-Medium mit und ohne Antibiotika bei einem Druck von 200 mbar. Der Druck wurde durch einen OB1-Mk3-Regler (Elveflow) gesteuert.

Die Bildgebung beginnt innerhalb von fünf Minuten nach der Zufuhr von Medium mit und ohne Antibiotika zu den Zellen. Wir verwendeten ein Nikon Ti2-E-Umkehrmikroskop, das mit einem Ölimmersionsobjektiv Plan Apo Lambda 100× (Nikon) ausgestattet war. Die Bilder wurden mit der Imaging Source-Kamera (DMK 38UX304) aufgenommen. Für Phasenkontrast- und Fluoreszenzbilder verwendeten wir den optischen Aufbau, wie zuvor in15,38 beschrieben und von Micro-Manager39 gesteuert, sowie ein selbst erstelltes Plugin. Mit einer temperaturregelbaren Einheit und einem Lexan-Gehäuse (Oklab) haben wir die Temperatur auf 30 °C gehalten.

Die Zellen wurden auf den Chip geladen und in zwei verschiedenen Reihen Wachstumsmedien mit und ohne Antibiotika ausgesetzt. In jeder Reihe wurden insgesamt 70–80 Positionen mit jeweils 16–21 Zellfallen eine Stunde lang alle zwei Minuten im Phasenkontrastkanal (30 ms Belichtungszeit) fotografiert.

Nach der Phänotypisierung wurde der Druck des Mediums aus den Anschlüssen 2.1 und 2.2 auf Null reduziert. Um die Zellen zu fixieren, wurde Formaldehyd (4 %) zugegeben, indem das Medium gewechselt und 4 Minuten lang ein Druck von 200 mbar über Anschluss 2.0 angelegt und die Zellen anschließend 3 Minuten lang mit 1 × phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen wurden. Die Zellen wurden 4 Minuten lang mit 70 % EtOH permeabilisiert und mit 1 × PBS (3 Minuten) gewaschen. Anschließend wurden die Zellen 3 Minuten lang mit Lysozym (2 mg/ml) und Lysostaphin (0,1 mg/ml) behandelt und anschließend weitere 3 Minuten lang schnell mit 1 × PBS gewaschen. (Lysostaphin wird nur für S. aureus benötigt und wurde in Abb. 3 nicht verwendet). Zur Artenidentifizierung haben wir alle spezifischen ssDNA-Sonden (0, 1 μM) (Supplementary Data 1) in einer Hybridisierungslösung (30% Formamid und 2 × SSC) gepoolt und 30 Minuten lang bei 30 ° C hybridisiert. Bei der kombinatorischen Methode haben wir alle Nachweissonden (0,1 μM) (Supplementary Data 2) und artspezifische Adaptersequenzen (Supplementary Data 3) in einer Hybridisierungslösung (30 % Formamid und 2 × SSC) gepoolt und hybridisiert 60 Min. bei 30 °C. Als nächstes haben wir die Fluoreszenzbilder für jede Sonde in verschiedenen Kanälen (TYE 665, TYE 563, Texas Red und Alexa Fluor 488) mit einer Belichtungszeit von 300 ms und entsprechende Phasenkontrastbilder mit einer Belichtungszeit von 30 ms aufgenommen. Insgesamt dauerte es 10–15 Minuten, alle Positionen in allen Kanälen auf dem Chip abzubilden.

Phasenkontrastbilder der in Kanälen wachsenden Zellen wurden mithilfe eines Deep-Learning-Modells mit der Omnipose-Methode sowohl für Zellen als auch für Kanäle segmentiert. Das Zellsegmentierungsmodell wurde mit Daten trainiert, die aus manuell beschrifteten Bildern gemischter Speziesdaten und Daten aus E. coli (K12 MG1655 intC::P70-venusFast) stammen, das mVenus konstitutiv exprimiert. Das Trainingsverfahren wurde durch Datenerweiterungen erweitert, um Lernergebnisse des Omnipose-Netzwerks in verschiedenen Ausrichtungen und Maßstäben zu erzwingen. Das Modelltraining und die Leistung im Vergleich zu U-net werden in SI-Methode 1 beschrieben. Die Leistung des Segmentierungsnetzwerks für verschiedene Arten wird auch in SI-Methode 1 gezeigt. Das Kanalsegmentierungsmodell wurde mit Daten trainiert, die auf der Grundlage der ebenfalls beschriebenen Histogrammprofile verfeinert wurden in SI-Methode 2. Nach der Ermittlung der Kanalpositionen wurden Zeitreihenstapel segmentierter Zellen und entsprechende Fluoreszenzkanalbilder zur Verfolgung, Artenzuordnung und Berechnung der Wachstumsrate gebündelt.

Zellen wurden im Laufe der Zeit mithilfe eines neuronalen Netzwerks verfolgt, das Verbindungen zwischen Zellen von einem Frame zum nächsten bewertet und die Art der Verbindung zwischen ihnen vorhersagt. Trainingsdaten für die Zellverfolgung wurden durch Simulation des Wachstums von Zellen in Mutter-Maschine-Kanälen gewonnen und sind in SI-Methode 4 beschrieben. Zellen unterschiedlicher Form, Größe und Wachstumsrate wurden verwendet, um Grundwahrheiten für das Tracking-Netzwerk zu generieren. Das Tracker-Netzwerktraining und seine Leistung werden in SI-Methode 4 beschrieben. Die Vorhersagen des Netzwerks werden mithilfe der IoU-Metrik (Intersection-over-Union) auf Fehler bereinigt, um falsche Vorhersagen zu entfernen. Zum Testzeitpunkt wurden Zellen zwischen Frames basierend auf den Wahrscheinlichkeitswerten verknüpft und Spuren wurden durch Verketten einer Reihe von Links generiert. Zellspuren wurden auf Fehler korrigiert (SI-Methode 4).

Für Experimente, bei denen eine einzelne Sonde an eine einzelne Spezies bindet, wurden Fluoreszenzbilder für jeden Muttermaschinenkanal hinsichtlich des Hintergrunds korrigiert und kontinuierliche Signalbereiche oberhalb der Schwellenwerte wurden auf Speziesmarkierungen abgebildet (SI-Methode 3). Experimente mit mehreren Fluoreszenzsonden für eine einzelne Art wurden mithilfe eines Random-Forest-Klassifikators klassifiziert, der in SI-Methode 6 beschrieben wird. Kontinuierliche Regionen, die einer Art entsprechen (>90 Pixel), wurden identifiziert und Begrenzungsrahmen um diese Regionen gezogen. Zellspuren, die im letzten Frame vor der Fixierung der Zellen in diese Regionen fielen, wurden mit der entsprechenden Art beschriftet und alle Artenbeschriftungen wurden auf den Zeitpunkt 0 zurückgesetzt. Die Wachstumsraten wurden durch Anpassen von Exponentialkurven an die Zellflächen in einem gleitenden 5-Zeitpunkt berechnet Fenster (SI-Methode 7).

FISH-Sondensequenzen für die einzelne Ziel-rRNA wurden von probeBase21,40,41 erhalten und von Integrated DNA Technologies (www.idt.com) erworben, siehe Ergänzende Daten 1. Für die kombinatorische FISH-Sondierung verwendeten wir Barcode-Sequenz- und Nachweissonden. die in den Zusatzdaten 2–4 aufgeführt sind und von IDT erworben wurden.

Alle Experimente wurden mit dem gleichen Aufbau durchgeführt. Sowohl behandelte als auch Referenzzellen verwendeten dieselben Segmentierungs- und Verfolgungsmodelle. Die Experimente waren nicht randomisiert. Für die Messung der Wachstumsrate wurde die Wachstumsrate jeder Art anhand von mindestens 100 Zellen berechnet. Zellen mit Segmentierungsfehlern wurden in den Wachstumsratenberechnungen nicht berücksichtigt. Alle AST-Profile zeigen normalisierte Wachstumsraten ± SEM. Detaillierte Informationen zu experimentellen Wiederholungen finden Sie in der Legende der einzelnen Figuren.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Rohe Mikroskopiedaten für alle in der Arbeit gezeigten Experimente sind unter https://doi.org/10.17044/scilifelab.20969161 verfügbar. Alle Analyseobjekte und Code sind auch unter https://doi.org/10.17044/scilifelab.20969161 verfügbar. Alle Stämme werden auf Anfrage an JE zur Verfügung gestellt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Der zur Analyse und Reproduktion aller Zahlen verwendete Code ist unter https://github.com/karempudi/ASTFISH.git verfügbar. Gewichte trainierter neuronaler Netze für die Zellsegmentierung und -verfolgung sind unter https://doi.org/10.17044/scilifelab.20969161 verfügbar.

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Wir möchten I. Barkefors für die hilfreichen Beiträge zum Manuskript und die Hilfe bei den Abbildungen danken. Wir danken der SSF (JE: ARC19-0016), dem Europäischen Forschungsrat (JE: BIGGER:885360), der Knut and Alice Wallenberg Foundation (JE: 2016.0077; 2017.0291; 2019.0439) und der eSSENCE e-Science-Initiative für die Finanzierung. Die Berechnungen und die Datenverarbeitung wurden durch Ressourcen ermöglicht, die von der schwedischen Nationalen Infrastruktur für Informatik (SNIC) bereitgestellt und teilweise vom schwedischen Forschungsrat durch die Fördervereinbarung Nr. finanziert wurden. 2018-05973.

Open-Access-Finanzierung durch die Universität Uppsala.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Vinodh Kandavalli, Praneeth Karempudi.

Abteilung Zell- und Molekularbiologie, Universität Uppsala, Uppsala, Schweden

Vinodh Kandavalli, Praneeth Karempudi, Jimmy Larsson und Johan Elf

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JE konzipierte die In-situ-ID nach der AST-Methode, und PK entwickelte und implementierte die Analysemethoden und analysierte die Daten. VK und JL führten die Experimente durch und entwickelten das Protokoll für die FISH-Sondierung im Fluidchip. JE, PK und VK haben den Artikel geschrieben.

Korrespondenz mit Johan Elf.

JE hat die Methode patentiert (US10.041.104) und die Firma Astrego Diagnostics gegründet. Alle anderen Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Nature Communications dankt Péter Horváth und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Kandavalli, V., Karempudi, P., Larsson, J. et al. Schnelle Antibiotika-Empfindlichkeitstests und Artenidentifizierung für gemischte Proben. Nat Commun 13, 6215 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-33659-1

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Eingegangen: 10. September 2021

Angenommen: 28. September 2022

Veröffentlicht: 20. Oktober 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-33659-1

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